多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，PPO)廣泛分布于植物細(xì)胞內(nèi)，因果蔬內(nèi)部組織的暴露而激活，可催化單酚羥基轉(zhuǎn)化為鄰二酚或?qū)⑧彿友趸甚?，而醌類物質(zhì)極易受到蛋白質(zhì)或氨基酸的親核攻擊生成黑色素，導(dǎo)致果蔬褐變。發(fā)生褐變的果蔬感官品質(zhì)急劇下降，營養(yǎng)成分被破壞，難以被消費者接受。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，高壓、熱、脈沖電場及化學(xué)抑制劑等處理手段在模型體系中對PP0活性展現(xiàn)出較好的抑制效果。然而，與模型體系相比，相同處理手段在食品體系中的鈍酶效果具有較大差異，PP0在食品體系中對熱和高壓鈍化的抵抗性普遍強于模型體系。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)梨(cv.Packham)PPO在模型體系(50mm01/L，pH6.0，Mcllvaine緩沖液)中經(jīng)70℃加熱10min后相對活性為16.7％；在梨泥食品體系中經(jīng)90℃加熱10min后，其活性仍高達(dá)37.8％同。此外，Dalmadi等發(fā)現(xiàn)草莓PP0在模型體系(100mm01/L，pH5.0，PBS)經(jīng)500～700MPa高壓處理15min后活性急劇下降，而Terefe等報道PPO在草莓泥食品體系中經(jīng)相同條件處理后活性無顯著變化。與食品體系相比，模型體系成分相對單一，食品體系中復(fù)雜的食品組分可能是這種差異形成的重要原因。

果蔬富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中果膠是一類由半乳糖醛酸及其衍生物組成的酸性雜多糖。廣泛分布于植物細(xì)胞的初生壁和中膠層中，構(gòu)成果蔬堅硬的質(zhì)地。果蔬在鮮切、榨汁和制作果蔬泥等加工過程中，由于機械損傷作用果膠可與PPO發(fā)生自然接觸，同時果膠作為食品添加劑也被廣泛應(yīng)用于果蔬制品。另一方面，在果蔬貯藏及澄清果蔬汁的制作過程中果膠又常被降解或除去，因此果膠是果蔬加工過程中的一個可控制因素。近年來針對食品中生物大分子問相互作用的研究逐漸興起，其中以蛋白質(zhì)與多糖二元復(fù)合物為典型代表。有研究報道果膠可通過靜電相互作用、范德華力以及氫鍵等非共價作用力與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生改變。因此，果膠作為一種果蔬加工過程中常被添加或去除的物質(zhì)，它與PPO之問的相互作用很可能影響果蔬制品中PPO活性、穩(wěn)定性及酶促褐變的發(fā)生。研究果膠對PPO活性及穩(wěn)定性的影響，不僅有助于控制果蔬制品酶促褐變，也為探討食品組分影響酶促褐變的機理提供理論參考。

本文以蘑菇PPO為主要研究對象，使用紫外分光光度計、熒光分光光度計等考察果膠對PPO酶促反應(yīng)活性、熱鈍化動力學(xué)、熱失活構(gòu)象變化以及抗壞血酸、檸檬酸、阿魏酸和水楊酸等有機酸抑制PPO活性的影響，以期從食品組分角度解釋PP0在模型體系和食品體系中出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的原因，為果蔬實際生產(chǎn)應(yīng)用及褐變控制方法的選擇提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇PP0(T3824-250ku，2687U/kg)、橘皮果膠(半乳糖醛酸≥74.0％)，美國Sigma-A1drich公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸，上海西隴科學(xué)股份有限公司：水楊酸，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸、阿魏酸、左旋多巴(L-DOPA)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600PC型紫外-可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；超純水系統(tǒng)，法國Millipore公司：HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省榮華有限公司；F-4500型熒光分光光度計，日本日立儀器有限公司；pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果膠-PP0溶液的制備

參考果膠在飲料及鮮果中所占的比重，以50mmol/LpH6.8的磷酸緩沖液為溶劑配制不同質(zhì)量濃度的果膠溶液和0.35mg/mL的PP0溶液以確保PP0活性在合適范圍內(nèi)，將果膠與PP0等體積混合使果膠質(zhì)量濃度最終分別為0，O.5，1，2，3，4，5，10和20mg/mL，PP0終質(zhì)量濃度為0.175mg/mL并置于25℃恒溫孵育30min。

1.3.2 PPO活性的測定

PP0活性的測定參照Liu等的方法,將0.1mL混合酶液加入到2.9mL2mm01/LL-DOPA溶液中開啟反應(yīng)，使用紫外-可見分光光度計于25℃監(jiān)測其在波長475nm處1min內(nèi)吸光度的變化值，通過斜率可計算PP0氧化L-DOPA的活性,以未添加果膠的PP0樣品為空白對照。

1.3.3 熱穩(wěn)定性與熱鈍化動力學(xué)分析

參照Terefe等和周磊等的方法，分別將PP0與不同質(zhì)量濃度果膠的混合溶液置于45～60℃水浴鍋中處理不同時間。以樣品中心溫度達(dá)到既定溫度時開始計時,加熱結(jié)束后立即置于冰水浴中迅速冷卻。其鈍化過程可用式(1)描述，通過線性回歸擬合可得到其鈍化動力學(xué)曲線。

式中，A₀-初始酶活，U；At-時間的相對酶活性，U；k-鈍化速率，min^-1；t-時間，min。

1.3.4 熒光光譜分析

參考Liu等的方法略作修改。使用F-4500型熒光分光光度計于25℃測定樣品的內(nèi)源熒光光譜，發(fā)射與激發(fā)狹縫寬均5nm，激發(fā)波長280nm，掃描波長范圍300～420nm，掃描速度1200nm/min,所有光譜均通過不含PP0的樣品光譜作為空白進(jìn)行修正。

1.3.5 抑制劑對PP0的抑制作用

選用抗壞血酸、檸檬酸、阿魏酸和水楊酸4種常見的有機酸，用濃度分別為0.6，1.2，1.8，2.4mm01/L的抗壞血酸溶液，濃度分別為5，10，15，20mmol/L的檸檬酸溶液，濃度分別為5，7.5，10，12.5mm01/L的阿魏酸溶液和濃度分別為1，4，7，1lmmol/L的水楊酸溶液處理含5mg/mL果膠的PP0溶液，30min后測定其相對活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS17.0和Origin8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性水平為0.05。

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