瑪咖是一種十字花科獨(dú)行菜屬草本植物，可以藥食兩用，我國衛(wèi)生部2011年正式審批瑪咖粉為新資源食品。研究表明瑪咖可以抗疲勞，增強(qiáng)體質(zhì)，其中瑪咖多糖可以提高機(jī)體的耐力，具有抗疲勞、抗氧化的功效。因此開展與瑪咖及其提取物相關(guān)的研究，對其進(jìn)一步的開發(fā)、推廣利用有著深遠(yuǎn)的意義。

目前，多糖的傳統(tǒng)提取工藝為乙醇沉淀法，此方法雖然能提取出大量的多糖，但是存在提取不徹底，原料利用率低，乙醇用量大等問題。三相萃取法提取多糖可以避免醇沉工藝的缺點(diǎn)，其原理是通過在水提液中加入無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑使其形成三相，上相為有機(jī)層，主要是色素、脂類等極性較小的物質(zhì)，中間相為蛋白質(zhì)層，下相為水層，主要是一些水溶性物質(zhì)。提取結(jié)束后，提取液中的有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽都可回收，是一種綠色高效提取多糖的工藝。本實(shí)驗(yàn)采用用叔丁醇-（NH₄）₂SO₄-提取液三相體系萃取瑪咖多糖，并通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并分析瑪咖多糖的抗氧化活性，為瑪咖的提純和開發(fā)利用提供科學(xué)的參考依據(jù)，能讓其發(fā)揮最大的市場經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

一、材料與方法

1、儀器與試劑

RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；LD-10型冷凍干燥機(jī)：湖南博瑞德生物有限公司；YT-1型分光光度計(jì)：無錫尚科儀器有限公司；TENSORII傅里葉變換近紅外光譜儀：德國BrukerOptics公司。

2、樣品來源

實(shí)驗(yàn)所需瑪咖隨機(jī)購于當(dāng)?shù)厮幉氖袌觥?/p>

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）瑪咖多糖三相萃取工藝流程

瑪咖→粉碎→蒸餾水提取→水提液濃縮→加入（NH₄）₂SO₄、叔丁醇→混勻→靜止萃取→分離、冷凍干燥→瑪咖多糖

（2）瑪咖多糖三相萃取工藝要點(diǎn)

蒸餾水提?。簩?0g瑪咖粉按料液比1:30（g/mL）加入蒸餾水，50℃水浴30min，提取1～4次。水提液濃縮：將提取液在50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至100mL。加入（NH₄）₂SO₄、叔丁醇：在提取液濃縮中加入10%～50%添加量的（NH₄）₂SO₄，再加入5～25mL的叔丁醇，形成三相體系。
混勻、靜止萃?。撼浞只靹蚝?，于20℃～60℃溫度下靜置萃取60min。分離、冷凍干燥：萃取后，形成三相；上層為叔丁醇相，主要含有脂類物質(zhì)，黃酮類；中間為相為蛋白質(zhì)；下層為（NH₄）₂SO₄相，主要含有瑪咖多糖，并通過分子透析法除去無機(jī)鹽后冷凍干燥得到瑪咖多糖。

（3）瑪咖多糖提取率的計(jì)算

采用苯酚-硫酸法測多糖含量，以外標(biāo)法測定瑪咖多糖質(zhì)量，并計(jì)算得到多糖提取率，計(jì)算公式如下：

瑪咖多糖提取率/%=（瑪咖多糖質(zhì)量/瑪咖粉質(zhì)量）×100

（4）單因素實(shí)驗(yàn)對瑪咖多糖提取條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)稱取10g瑪咖粉，以水提法分別提取1、2、3、4次，合并提取液濃縮至100mL，以三相萃取法提取瑪咖多糖，提取濃縮并冷凍干燥后制得瑪咖多糖，測定瑪咖多糖含量并計(jì)算提取率。分別研究（NH₄）₂SO₄添加量10%、20%、30%、40%、50%，叔丁醇添加量5、10、15、20、25mL，萃取溫度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的條件下，對瑪咖多糖提取率的影響。

（5）響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對瑪咖多糖提取條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，選?。∟H₄）₂SO₄添加量，叔丁醇添加量、萃取溫度3個(gè)因素，采用Design-expert8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

（6）瑪咖多糖清除·OH能力的測定

參照水楊酸法，分別取0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL瑪咖多糖溶液各2mL置于10mL的試管中，再加入2mL硫酸亞鐵（0.005moL/mL）、2mLH₂O₂，靜置5.0min后，再加入2mL的水楊酸溶液（0.005moL/mL），在37℃溫度下水浴10min，波長510nm條件下測定吸光度X值。X₀為空白對照組的吸光度值，X₁為蒸餾水代替瑪咖多糖溶液的吸光度值，X₂為瑪咖多糖溶液的吸光度值，并以維生素C作為對照組，·OH清除率計(jì)算公式如下所示：
 

（7）瑪咖多糖清除DPPH·能力的測定

參照相關(guān)文獻(xiàn)，準(zhǔn)確吸取2mL濃度為0.2mmoI/LDPPH·甲醇溶液置于10mL的試管中，再分別加入濃度2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/m的瑪咖多糖溶液各2mL，并在37℃水浴條件下反應(yīng)10min，于波長517nm條件下測定吸光度值X。X₀為空白對照組的吸光度值，X₁為加入瑪咖多糖溶液后吸光度值，并以維生素C作為對照組，DPPH·清除率計(jì)算公式如下所示：

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