紐莫康定B₀(Pneumocandin B₀)是棘白菌素類化合物，其半合成衍生物卡泊芬凈(Caspofungin)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療無效或無法耐受其他抗真菌藥的患者的侵襲性曲霉病。作為合成真菌藥物卡泊芬凈的中間體，紐莫康定B₀由真菌Zalerion arboricola發(fā)酵產(chǎn)生，發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生與紐莫康定B₀結(jié)構(gòu)相近的副產(chǎn)物及大量的色素。按照結(jié)構(gòu)中脯氨酸上取代基的不同主要分為A₀，B₀和C₀，其中B₀，C₀分別為同分異構(gòu)體。由于C₀為B₀生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵雜質(zhì)，在生產(chǎn)純化過程中去除C₀有一定的難度。因此，開發(fā)出一種有效的方法得到高純度的紐莫康定B₀對于后續(xù)合成卡泊芬凈尤為重要。

色譜分離法在化合物的分離中應(yīng)用較為廣泛，且色譜純度、回收率和分離效率等方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的制備方法，其中色譜純度通過面積歸一化法得到。相比于中低壓色譜制備，高壓色譜制備效率高、柱效高。筆者以實(shí)驗(yàn)室制得的紐莫康定B₀粗品為原料，通過高壓制備對紐莫康定B₀進(jìn)行了放大中試研究，開發(fā)出了一種生產(chǎn)周期短、成本低和色譜純度高的制備工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

U3000高效液相色譜儀，賽默飛Thermo公司；Cs-prep150工業(yè)制備色譜系統(tǒng)，漢邦科技；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHJK-2020低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCIENTZ-12ND冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試 藥

工業(yè)級二氯甲烷，山東金嶺化工股份有限公司；工業(yè)甲醇，兗礦國宏化工有限責(zé)任公司；改性硅膠，蘇州納微科技股份有限公司；紐莫康定B₀粗品，魯南新時(shí)代生物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)81.20%;紐莫康定B₀對照品，大同市礦區(qū)風(fēng)華生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.56%，批號16001;紐莫康定C₀對照品，大同市礦區(qū)風(fēng)華生物科技有限公司贈(zèng)與，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.11%，批號16002;乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 HPLC(高效液相色譜)法測定B₀

紐莫康定B₀檢測方法：Thermo Hypersil GOLD C18，4.6 mm×250 mm， 5 μm; 以V(乙腈)∶V(水)=45∶55為流動(dòng)相，等度洗脫；檢測波長210 nm， 柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流量1 mL/min， 運(yùn)行時(shí)間45 min。以紐莫康定B₀對照品進(jìn)行外標(biāo)法定量。紐莫康定B₀對照品溶液的配制：取紐莫康定B₀對照品約20 mg， 精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加乙醇超聲溶解后，稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為400 mg/L的紐莫康定B₀對照品溶液。供試品溶液配制：對制備液用氮?dú)獯蹈桑右掖颊駬u使溶解并稀釋至質(zhì)量濃度約1 000 mg/L，搖勻，用0.22 μm有機(jī)濾頭過濾。紐莫康定B₀的結(jié)構(gòu)式為

2.2 HPLC(高效液相色譜)法測定C₀

檢測方法為公司自行開發(fā)，線性梯度洗脫程序如表1所示。Welch Ultimate HILIC Amide柱，4.6 mm×250 mm， 3.5 μm; 波長220 nm， 流量1.0 mL/min， 進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈。

以紐莫康定C₀對照品進(jìn)行外標(biāo)法定量，紐莫康定C₀對照品溶液的配制與紐莫康定B₀對照品溶液的配制相同。紐莫康定C₀的結(jié)構(gòu)式為

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