2.4細(xì)菌16SrRNA分子鑒定

16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖4)表明,從細(xì)菌 菌株的DNA模板中擴(kuò)增出大小約為1400 bp左右的片 段,符合預(yù)期結(jié)果,序列號(hào)為MN736843,將基因序列通過NCBI進(jìn)行同源比對(duì)分析,結(jié)果顯示與該序列同 源性比最高的菌株均是豚鼠氣單胞菌，將序列與已知 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),可以看出,該菌株與豚鼠氣單胞菌(A. caviae)聚為一個(gè)分支,結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)和革 蘭氏染色等結(jié)果,可確定該分離菌株為豚鼠氣單胞菌。

2.5人工感染

經(jīng)過人工感染的羅氏沼蝦出現(xiàn)與自然水域患病蝦 相似的癥狀,感染羅氏沼蝦出現(xiàn)鰓絲紅腫,鰓絲表面出 現(xiàn)黑斑等癥狀(圖6),感染組在7天內(nèi)全部死亡，而對(duì) 照組沒有出現(xiàn)異常。從人工感染瀕臨死亡的羅氏沼蝦 肝胰腺組織內(nèi)再次進(jìn)行細(xì)菌分離純化，將分離菌株再 次進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)以及分子學(xué)鑒定等,得到與原分 離菌株相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,證明該分離菌株為羅氏沼蝦致病菌-豚鼠氣單胞菌(A.caviae).

3討論

豚鼠氣單胞菌(A.caviae)隸屬于氣單胞菌科.氣單 胞菌屬，是威脅中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物健康的主要致病菌之一,能夠?qū)е氯毡决狑~(Anguillajaponica).胡子鯰(Clarias fuscus).中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis). 中國(guó) 對(duì)蝦(Penaeus chinensis). 南方鲇(Silurus meriordinalis Chen)、中華鱉(Triongxsinensis)等多種水產(chǎn)動(dòng)物感染。本次研究從患病的羅氏沼蝦體內(nèi)分離出致病 菌，井將得到的優(yōu)勢(shì)菌株通過細(xì)菌形態(tài)觀察.革蘭氏染 色、溶血試驗(yàn)以及生理生化分析可初步判斷該分離菌 株為豚鼠氣單胞菌(A. caniae).其16S rRNA基因序列 構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果顯示該分離菌株與豚鼠氣單胞菌聚 為一族,綜合所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果可確定該分離菌株為豚鼠 氣單胞菌。使用該分離菌株對(duì)健康羅氏沼蝦進(jìn)行人工 感染.感染后的羅氏沼蝦表現(xiàn)出與自然水城條件下患 病蝦相似的癥狀,并對(duì)感染后的羅氏沼蝦再次進(jìn)行細(xì) 菌分高純化.得到與豚鼠氣單胞菌相似的菌株,進(jìn)一一步: 證明了該細(xì)菌在羅氏沼蝦體內(nèi)的致病性,同時(shí)也對(duì)豚 鼠氣單胞菌的病原研究資料進(jìn)行了一定的補(bǔ)充。

對(duì)分離菌株的生理生化特性進(jìn)行鑒定,該病原菌 對(duì)氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖產(chǎn)酸、蛋白胨水.精氨酸水 解酶、明膠.苯丙氨酸為陽(yáng)性:硫化氫.丙二酸鹽.賴氨 酸脫發(fā)酶。鳥氨酸脫羧酶。枸緣酸鹽.V-P .葡萄糖酸鹽 為陰性,豚鼠氣單胞菌的生理生化特性存在菌株差異 性，本研究分高的豚鼠氣單胞菌對(duì)枸櫞酸鹽和蛋白胨 水的鑒定結(jié)果與模式氣單胞菌相反,出現(xiàn)上述差異的 原因可能是由于養(yǎng)殖環(huán)境、氣候條件.地理位置.寄主 體不同造成的。目前.,在水產(chǎn)動(dòng)物中普遍使用抗菌藥 物對(duì)疾病進(jìn)行防治，本次研究的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該 分離菌株對(duì)頭孢曲松.氣霉素、氟苯尼考四環(huán)素、多西 環(huán)素s種藥物高度敏感,對(duì)卡那霉素1種藥物中度敏 感.對(duì)環(huán)丙沙星。諾氟沙星、紅霉素.阿奇霉素新生霉 素.鏈霉素.復(fù)方新諾明和利福平8種藥物耐藥。本次 研究結(jié)果與已報(bào)道的其他品種分高出的脈鼠氣單胞菌 的藥物敏感性存在一-定差異1,這表明豚鼠氣單胞菌 對(duì)藥物敏感性存在一-定的差異,這可能和不同的地區(qū)。 不同養(yǎng)殖環(huán)境中藥物種類以及藥物使用程度不同有關(guān)于細(xì)菌的鑒定方法有很多,例如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò) 增技術(shù).單克隆抗體和間接ELISA法等.16SrRNA在 細(xì)菌染色體的基因組中普遍存在,含高度保守區(qū)城且 分子大小始終?；贗6SrRNA基因序列分析具有簡(jiǎn) 易、高效等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為細(xì)菌鑒定以及親緣關(guān)系判斷 的一一種有效的工具,但是因?yàn)镮6SrRNA可能存在一一些 不清晰的位點(diǎn)且基因數(shù)目有限,所以給序列的分析帶 來不便，本次研究對(duì)分離細(xì)菌的16SrRNA基因及其系 統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析,并與生理生化特性和革蘭氏染色 等方法相結(jié)合,進(jìn)而判斷該分離菌株為脈鼠氣單胞菌， 提高了細(xì)菌鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。

目前，已鑒定的氣單胞菌屬主要分離自人和不同 的動(dòng)物寄主:從患病水生動(dòng)物以及人感染的傷口中分離-有的還能在食物中分離純化得到PPABLOS等 從腹瀉病患.飲水以及食品分離的氣單型菌進(jìn)行鑒定﹐ 結(jié)果表明,人源氣單胞菌和飲水源氣單型菌較為接近， 說明氣單型菌可以通過水源傳播到人類,從而導(dǎo)致人 癸產(chǎn)生疾病P樊海平等*從發(fā)生敗血癥的中國(guó)對(duì)蝦 分離純化出豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌,但是關(guān)于 從羅氏沼蝦中分離到豚鼠氣單胞菌以及以豚鼠氣單胞 菌感染為主的羅氏沼蝦疾病的報(bào)道較少,羅氏沼蝦豚 鼠氣單胞菌是否能夠?qū)е氯撕推渌鷦?dòng)物發(fā)病﹐它 和人源氣單胞菌有無親緣關(guān)系,以及其致病機(jī)理均有 特進(jìn)一步研究。因此,后期還需要進(jìn)一步進(jìn)行該病璧 菌的流行病學(xué)調(diào)查，了解其發(fā)病的規(guī)律,并確認(rèn)其危害 的對(duì)象以及研究其致胸機(jī)理等,將更有利于對(duì)該致病 菌引起的羅氏沼蝦疾病進(jìn)行有效的防控,促進(jìn)羅氏沼 蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展-

抗生素等藥物是保持水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)動(dòng)物健康生產(chǎn)以 及病 例治的重要途徑。可是由于當(dāng)前水產(chǎn)市場(chǎng)抗生 素種類太多,以及用藥習(xí)慣不一樣，導(dǎo)政漁藥使用相對(duì) 混亂,細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象也越來越嚴(yán)重,所以在水產(chǎn)動(dòng)物 中對(duì)抗生素藥物的選擇和使用一定要有科學(xué)性,對(duì)病 甌菌揉使用抗生素等藥物治療,必須參考其藥敏實(shí)驗(yàn) 結(jié)果,嚴(yán)格遵循水產(chǎn)藥物使用的相關(guān)規(guī)定﹐同時(shí)還要注 愈穿梭用藥以及藥物使用濃度.盡量避免藥物的殘留， 本次研究為羅氏沼蝦豚鼠氣單廄菌鑒定以及病害劭治 提供一定的參考和理論基礎(chǔ)-

4結(jié)論

本研究從患病的羅氏沼蝦中分離出一糅致病菌- 豚鼠氣單胞菌,并通過對(duì)其菌落形態(tài)特征.生理生化鑒 定并結(jié)合16SrRNA序列分析,可判斷該致病菌為豚鼠 氣單慰菌.人工感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該致病菌對(duì)羅氏沼蝦 具有較強(qiáng)的致病性.藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明該致病菌對(duì)頭 泡曲松.氯霉素.氟苯尼考.四環(huán)素.多西環(huán)素5種藥物 高度敏感,而對(duì)環(huán)丙沙星.諾氟沙星.紅霉素.阿奇霉 素.新生霉素鏈霉素.復(fù)方新諾明和利福平8種藥物 耐藥,因此可參考藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)羅氏沼蝦豚鼠氣單 巍菌使用合適的藥物進(jìn)行治療﹐以達(dá)到最佳治療效 果-水研究所選的環(huán)丙沙星和氯霉素僅用來研究菌棵 的抗藥性，并不能用于生產(chǎn),面氟苯尼考可以作為羅氏 沼蝦豚鼠氣單脫菌的主要治療藥物。這也握醒養(yǎng)殖戶 和研究生產(chǎn)人員在羅氏沼蝦養(yǎng)殖過程中,要在國(guó)家覺 許藥物使用范圍之內(nèi),選取最佳眩感藥物用來進(jìn)行病 害防治,提高用藥的針對(duì)性，做到合理慎重用藥,盡量 減少藥物殘留.o研籠為進(jìn)一步探討羅氏沼蝦豚鼠氣 單胞菌的鑒定和防治提供一定的參考.

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：抗生素，羅氏，諾氟沙星