3.3全式金試劑盒提取集聚性大腸桿菌基因組方法優(yōu)化

采用全式金細菌基因組DNA試劑盒標準提取方法中革蘭氏陽性菌提取方法進行集聚性大腸桿菌基因組的提取，并對提取方法改進。

第一步材料處理。在菌液的重懸液中加入200μL RB11試劑（含溶菌酶4 mg）后在37℃的孵育時間由原來的1 h改為40min，加入蛋白酶K后在55℃的孵育時間由原來的15 min延長至30 min，洗脫后測定收集到溶菌酶裂解處理后的基因組DNA樣品的純度及濃度，見表6。由表可以看出，經(jīng)溶菌酶孵育處理后EAEC基因組DNA的提取量增大了近3倍。電泳分析結(jié)果如圖3所示。由圖可以看出，所提取的基因組條帶均一，無RNA污染。在提取過程中，加入試劑LB11與蛋白酶K經(jīng)55℃孵育30min后，菌液仍非常黏稠，因此推測EAEC菌體細胞成分較為復(fù)雜，可能是蛋白質(zhì)含量較高，加入的蛋白酶K未能完全消化菌體蛋白，導(dǎo)致裂解液非常黏稠，不利于后續(xù)基因組DNA的提取，后續(xù)實驗提高蛋白酶K的用量至40 mg/L。

增大蛋白酶K的用量后，菌體裂解液黏稠度明顯降低，將其轉(zhuǎn)移到吸附離心柱中離心后，液體易于通過吸附膜，因此，為了提高基因組的濃度，取3倍體積菌體裂解液用于提取基因組。表7為提高蛋白酶K用量后提取集聚性大腸桿菌基因組的純度和濃度。由表可知，采用革蘭氏陽性菌基因組DNA提取方法并增大1倍蛋白酶K的用量后，集聚性大腸桿菌基因組的濃度達到了197.7 mg/L，較標準方法提取的基因組的濃度增大了約14.5倍，但基因組純度沒有提高，推測所提取的基因組中仍有蛋白質(zhì)等碳水化合物或無機鹽、有機試劑的污染。由于所提取的基因組DNA用于制備定性核酸標準樣品，因此模板DNA的純度對聚合酶鏈式反應(yīng)擴增基因組的特征基因時影響較小。瓊脂糖凝膠電泳分析提高蛋白酶用量后的腸道集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組結(jié)果如圖4所示。由圖可以看出，所提取的EAEC基因組條帶明顯，未見降解，無RNA污染，表明該優(yōu)化方法能有效提高基因組DNA的濃度。

3.4集聚性大腸桿菌毒力基因PCR擴增檢測

根據(jù)國家標準GB 4789.6—2016的方法，對所提取的集聚性大腸桿菌基因組進行檢測。以所提取的集聚性大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增其特征基因astA、aggR、pic和uidA，并對其擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖5所示。astA、aggR、pic基因為集聚性大腸桿菌的特征毒力基因，uidA基因可在97%的大腸桿菌內(nèi)檢測到，4個基因的檢測結(jié)果均為陽性，PCR產(chǎn)物條帶大小與目的片段大小相符，說明所提取的基因組確為集聚性大腸桿菌基因組。盡管所提取基因組的純度指標A260/A2 8 0和A260/A2 3 0均未達到1.8，但是根據(jù)毒力基因擴增結(jié)果可知，所制備的基因組樣品對于定性核酸標準樣品的檢測結(jié)果無影響，可用于制備定性核酸標準樣品。

4結(jié)論

對比使用多種細菌基因組DNA提取試劑盒提取EAEC基因組的提取效果可知，由于EAEC細胞裂解液非常黏稠，不利于后續(xù)的基因組提取，因此提取到的EAEC基因組的濃度及純度均非常低。4種試劑盒中全式金試劑盒提取步驟簡便，耗時少，因此對該試劑盒提取過程進行優(yōu)化。通過增加30 min的溶菌酶孵育、1倍蛋白酶K的用量及2倍體積的菌體裂解液，EAEC基因組的提取濃度提高了14.5倍，以所提取的基因組為模板，PCR檢測EAEC的特征毒力基因，結(jié)果顯示3個特征毒力基因均為陽性，滿足用于制備食品檢測用核酸定性參考物質(zhì)的要求。本文中的研究為大量提取核酸定性標準樣品的前期樣品奠定了基礎(chǔ)，同時也為基因組提取困難的細菌基因組的提取方法探索提供了參考。

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