本試驗(yàn)通過(guò)已經(jīng)建立的熒光PCR方法，對(duì)四川部分地區(qū)自然環(huán)境中的包蟲蟲卵進(jìn)行檢測(cè)，采集包蟲流行地區(qū)石渠縣、色達(dá)縣、甘孜縣、爐霍縣、天全縣和寶興縣的環(huán)境樣本，提取樣本總DNA，采用熒光PCR對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲ND1基因進(jìn)行檢測(cè)；結(jié)果顯示，共采集犬糞850份，陽(yáng)性82份，陽(yáng)性率12. 4%；土壤61份，陽(yáng)性8份，陽(yáng)性率13. 1%；犬毛39份，陽(yáng)性3份，陽(yáng)性率7. 7%；水樣80份，均未檢出。本次調(diào)查顯示，犬糞、土壤以及犬毛均檢出包蟲蟲卵DNA，土壤是一個(gè)不可忽視的傳播因素。提示有必要加強(qiáng)對(duì)環(huán)境中蟲卵的監(jiān)測(cè)并篩選殺滅環(huán)境中蟲卵消毒劑，以確保包蟲病流行區(qū)域人和家畜的安全。

細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲引發(fā)的棘球蚴病，統(tǒng)稱包蟲病，是一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，主要感染人、牛羊等家畜以及小型嚙齒類動(dòng)物。包蟲病不僅嚴(yán)重危害居民健康，而且導(dǎo)致包蟲病患者因病返貧，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。四川、青海、寧夏、甘肅以及新疆等省是包蟲病高發(fā)地區(qū)，其中四川省的甘孜州和阿壩州全州、雅安市的天全縣和寶興縣以及涼山州的木里縣和越西縣均是包蟲病流行區(qū)域。

人和動(dòng)物感染包蟲病主要是經(jīng)口感染 (比如誤食被包蟲蟲卵污染的水和食物，手接觸了被蟲卵污染的土壤或者犬的皮毛) ，蟲卵經(jīng)口進(jìn)入胃，在宿主消化液作用下發(fā)育成六鉤蚴經(jīng)腸壁進(jìn)入血液。中絳期的幼蟲可在患者及動(dòng)物體內(nèi)像腫瘤樣生長(zhǎng)發(fā)育和侵潤(rùn)遷移，對(duì)肝臟等臟器損害嚴(yán)重。包蟲的蟲卵已在孕節(jié)內(nèi)提前發(fā)育為六鉤蚴，不需要在外界環(huán)境中發(fā)育，因此隨糞便排出的蟲卵已經(jīng)完全發(fā)育成熟，對(duì)人和其他中間宿主均已具有感染力。除此之外，蟲卵對(duì)低溫抵抗力極強(qiáng)，能在外界環(huán)境中長(zhǎng)期存活并保持感染力。細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵-80℃至少需要7 d方能徹底滅活，而在7℃可存活200 d以上，21℃可存活50天。多房棘球絳蟲蟲卵在實(shí)驗(yàn)室4℃水中可存活16個(gè)月。在德國(guó)南部，秋冬季節(jié)可存活8個(gè)月，夏季可存活78 d，在潮濕土壤中也可存活很長(zhǎng)時(shí)間。

本試驗(yàn)的目的是對(duì)本省包蟲病流行地區(qū)自然環(huán)境中包蟲蟲卵污染情況進(jìn)行初步調(diào)查，為進(jìn)一步完善包蟲病防控措施提供數(shù)據(jù)及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

共采集新鮮犬糞850份，其中：石渠縣103份、爐霍縣97份、甘孜縣90份、天全縣281份、寶興縣279份；土壤樣本61份，取地表土層1 cm內(nèi)的土壤，每份100 g左右，其中：石渠縣A鄉(xiāng)20份、石渠縣B鄉(xiāng)21份，爐霍縣10份、色達(dá)縣10份，所有土壤樣本均采集于犬舍為中心100平米范圍內(nèi)；犬頸部毛發(fā)樣本39份，其中石渠縣A鄉(xiāng)20份、石渠縣B鄉(xiāng)19份；公路旁地表水樣本80份，其中石渠縣A鄉(xiāng)30份、石渠縣B鄉(xiāng)10份、石渠縣C鄉(xiāng)20份以及爐霍縣20份，每份50 m L左右。由于犬糞是環(huán)境中蟲卵的唯一來(lái)源，所以采集犬糞、犬舍周圍土壤及犬毛過(guò)程中，必須做好安全防護(hù)，避免感染包蟲蟲卵。

1.2 主要試劑及儀器

Power SYBR Green PCR Master Mix，購(gòu)自ABI公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；糞便及土壤樣本徹底破碎采用Bertin Precellys 24組織破碎儀；樣本總DNA提取采用E.Z.N.A Stool DNA Kit；最終檢測(cè)儀器為杭州博日9600型熒光PCR儀。

1.3 核酸的提取

所有樣本的核酸提取均采用E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。其中，土壤及犬糞樣本需用Bertin Precellys 24組織破碎儀充分破碎后再進(jìn)行核酸提?。凰w樣本需至少13 000 r/min離心5 min后收集沉淀，再進(jìn)行核酸提??；犬毛需在50 m L試管中，用超純水充分震蕩洗滌后，13 000 r/min離心5 min后收集沉淀，提取核酸。所有樣本最后洗脫的總DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)方法

通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲G1，G6和G7株及多房棘球絳蟲大量序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取線粒體上ND1基因作為檢測(cè)基因，產(chǎn)物長(zhǎng)度為98 bp，所用引物序列及反應(yīng)體系均采用先前本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[7]。PCR體系為50μL，上下游引物終濃度分別為0.3μmol/L，模板1-3μL (約為5 ng) 。反應(yīng)條件為預(yù)變性：94℃5 min；變性94℃30s，60℃退火及延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，按照儀器默認(rèn)設(shè)置添加熔解曲線分析步驟。其中陽(yáng)性對(duì)照細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲陽(yáng)性DNA均由本實(shí)驗(yàn)保存。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果

所有樣本檢測(cè)結(jié)果如表1所示，犬糞樣本：石渠縣、爐霍縣、甘孜縣、天全縣和寶興縣包蟲陽(yáng)性率分別為3.9%、38.1%、27.8%、100%、6.1%和8.2%，總陽(yáng)性率為12.4%；土壤樣本：石渠縣A鄉(xiāng)、石渠縣B鄉(xiāng)、爐霍縣和色達(dá)縣陽(yáng)性率分別為15.0%、14.3%、20.0%和0，總陽(yáng)性率為13.1%；犬毛樣本：石渠縣A鄉(xiāng)和石渠縣B鄉(xiāng)陽(yáng)性率分別為10.0%和5.3%，總陽(yáng)性率為7.7%；所有水體樣本均為陰性。

2.2 PCR產(chǎn)物的特異性

通過(guò)熔解曲線分析，所有陽(yáng)性樣本的熔解峰均與陽(yáng)性對(duì)照吻合，且均為單峰，說(shuō)明整個(gè)PCR反應(yīng)特異性好，產(chǎn)物均為目的基因產(chǎn)物，無(wú)非特異性產(chǎn)物。

3 討論

四川省甘孜州和阿壩州全州、雅安市的寶興縣和天全縣、涼山州的木里縣和越西縣是包蟲病流行區(qū)域，其中甘孜州、阿壩州的部分地區(qū)屬于重度流行區(qū)。尤其是甘孜州的石渠縣，是全世界包蟲病研究中心，同時(shí)也是最嚴(yán)重的地區(qū)，而寶興縣、天全縣、木里縣和越西縣均屬于輕度流行區(qū)。

犬糞便中的蟲卵是感染人和動(dòng)物的唯一階段，感染途徑主要是犬糞污染環(huán)境，包括土壤、水源以及犬體表的被毛等，人和動(dòng)物通過(guò)直接接觸犬糞以及上述被犬糞污染的環(huán)境，經(jīng)口攝入蟲卵導(dǎo)致感染。由于包蟲蟲卵已在體內(nèi)發(fā)育成熟，排出犬體外就已經(jīng)具有感染性，而且對(duì)低溫具有很強(qiáng)抵抗力，所以一旦犬糞污染周圍環(huán)境，很容易造成人和動(dòng)物感染包蟲。造成犬糞污染環(huán)境主要有以下因素：

(1) 當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)包蟲病認(rèn)識(shí)及重視程度低，犬只不經(jīng)常拴養(yǎng)，導(dǎo)致犬糞污染居住地周邊環(huán)境

 (2) 夏季牧場(chǎng)時(shí)期，犬只需保護(hù)家畜免遭狼、狐貍捕食，必須自由活動(dòng)，無(wú)法拴養(yǎng)

(3) 當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)犬糞無(wú)法進(jìn)行有效處理：高原地區(qū)地廣人稀，居住分散，很難做到犬糞的統(tǒng)一回收、消毒和處理，因此犬糞長(zhǎng)時(shí)間暴露于外界環(huán)境中。

據(jù)報(bào)道，在波蘭，從當(dāng)?shù)胤N植的蔬菜表面、野生蘑菇及土壤中均檢測(cè)出了多房棘球絳蟲蟲卵DNA。犬糞中的蟲卵粘附于犬被毛，也是造成人感染的一個(gè)重要途徑。川西北地區(qū)的甘孜州和阿壩州大部分地區(qū)犬只數(shù)量眾多，以甘孜州石渠縣為例，目前登記在冊(cè)的犬只大約2萬(wàn)只左右，家家養(yǎng)犬，人與犬接觸頻繁，尤其是兒童，在與犬接觸玩耍后未能馬上洗手，很容易將犬體表被毛上的蟲卵攝入口中，造成感染。2017年9月本人在石渠縣德榮瑪鄉(xiāng)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，就有6~12歲兒童感染包蟲的病例。另?yè)?jù)報(bào)道，在哈薩克斯坦，1988-1995年期間，包蟲發(fā)病率在1.4人/10萬(wàn)，但從1997-2000年增長(zhǎng)到了3.5~8.3人/10萬(wàn)，其中29%的患者是年齡14歲以下的兒童。犬糞也可能污染地表水源，但在本研究中所有水體樣本均未檢出包蟲蟲卵，原因可能是水源中即使被污染蟲卵，數(shù)量也很少，加之每份樣本量只有50 m L，很難富集到蟲卵。因此，對(duì)地表水源中蟲卵的檢測(cè)可能需要設(shè)計(jì)專門的過(guò)濾裝置，前期對(duì)大量水體進(jìn)行過(guò)濾，富集蟲卵，才有可能檢出。本試驗(yàn)中采用的熒光PCR方法，特異性強(qiáng)，靈敏度高，能夠同時(shí)檢出細(xì)粒和多房棘球絳蟲，尤其適合復(fù)雜樣本 (犬糞、土壤) 中目的基因的檢測(cè)，而且對(duì)ELISA陰性/陽(yáng)性樣本復(fù)核率高，不存在漏檢和假陽(yáng)性，非常適合后期環(huán)境中蟲卵的持續(xù)監(jiān)測(cè)。

寄生蟲蟲卵普遍具有堅(jiān)固的外殼，除對(duì)外界不良環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性外，還對(duì)常規(guī)的消毒劑具有很強(qiáng)的抵抗力，如柔嫩艾美耳球蟲的卵囊在次氯酸鈉溶液中浸泡0.5 h，對(duì)其活力及感染性無(wú)明顯影響。由于包蟲蟲卵污染的均為自然環(huán)境，如土壤、草地、犬的被毛等，存在大量易與消毒劑發(fā)生反應(yīng)的有機(jī)物，導(dǎo)致消毒效果大大降低，無(wú)法達(dá)到殺滅蟲卵的效果。因此，后期迫切需要篩選合適的消毒劑，用于高原地區(qū)環(huán)境中蟲卵的殺滅，以確保人和家畜的安全，提高當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生水平。

綜上所述，本研究在犬糞、土壤及犬毛樣本中均檢出了包蟲蟲卵DNA，說(shuō)明當(dāng)?shù)鼐用癫糠殖潭壬洗嬖趶沫h(huán)境中感染包蟲的風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)從2015年開始，投入大筆專項(xiàng)資金，全面開展包蟲病防控工作，包括犬只管理與驅(qū)蟲、牛羊免疫、草原鼠害治理以及包蟲病宣傳教育等措施，取得了顯著效果。在此基礎(chǔ)上，如能進(jìn)一步開展環(huán)境中包蟲蟲卵的持續(xù)監(jiān)測(cè)，將為進(jìn)一步降低人和動(dòng)物感染包蟲風(fēng)險(xiǎn)，以及完善包蟲病防控體系提供數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)支持。

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